小尾寒羊腔前卵泡體外生長發育的研究

WWW． s y d k z z ． c o m 2 O 1 5 年1 月下 小尾寒羊腔前卵泡體外生長發育的研究 張 劍 ( 陜西省韓城市動物衛生監督所 ，陜西韓城7 1 5 4 0 0 ) 近2 0 年來 ，胚胎移植 、體外受精 、核移植 、轉基因等胚胎工 程技術在理論和生產應用上已取得 了很大進展。然而 ，所有這些 技術是建立在具有完全發育能力 的卵母 細胞的基礎之上的。大量 卵母細胞的體外成熟培養是這些技術的限速步驟之一。 目前采用 的有腔卵泡卵母細胞的體外成熟和超數排卵，不能提供充足的卵 母細胞以支撐胚胎工程技術的進一步發展。此外，卵巢中的卵母 細胞絕大多數以無腔的形式存在于卵巢皮質內，有腔卵泡所占比 例不到 1 ％，屠宰場屠宰羊只后 的卵巢 內含有大量的腔前卵泡。 如果建立腔前 卵泡的體外培養體系 ，獲得大量的具有成熟和受精 能力的卵母細胞 ，一方 面將會最大限度地挖掘保存卵巢上遺傳資 源 ；另一方面將極大的促進胚胎工程技術 的研究 與應用 ，還有利 于研究卵泡和卵母細胞的生長和發育規律。 I e w l a n d( 1 9 8 7) 率先在小 鼠等嚙齒類動物上研究腔前卵泡生 長發育，而且獲得了來 自腔前卵泡卵母細胞的仔鼠。隨后在大動 物家畜上也進行了腔前卵泡的分離和培養的研究 ，但一直沒有取 得滿意的結果。Hi a r o 等 ( 1 9 9 4) 將豬腔前卵泡卵母細胞體外分離 培養，發育成熟后授精 ，盡管精子能穿人卵母細胞，但未形成原 核。但是Wu j i 等 ( 2 0 0 1 ) 將豬腔前卵泡進行體外培養，有5 1 ％的 卵母細胞完成減數分裂至MI I 期，其中成熟的卵母細胞中有5 3 ％ 完成受精 ，4 3 ％的受精卵分裂，1 3 ％發育至囊胚期。G u t i e r r e z 等 ( 2 0 0 0)首次報道牛腔前 卵泡在體外 能生長發育到有 腔卵泡階 段。周歡敏和張涌 ( 1 9 9 9 )發現山羊腔前卵泡卵母細胞在體外能 存活并生長發育到成熟時的大小。C e c c o n i 等 ( 1 9 9 9 )將綿羊腔前 卵泡體外培養到有腔卵泡階段，并發現在卵泡液中含有雌二醇； 而N e w t o n 等 ( 1 9 9 9) 將綿羊腔前卵泡在無血清條件下培養到有腔 卵泡階段，但是能否繼續培養及成熟排卵，能否正常受精發育等 一 系列的后續事件無相關報道。而近十年來，有關哺乳動物腔前 卵泡的體外培養都是有關細胞因子 ( T a k a h a s h i ，等2 0 1 3)、激 素以及血清替代物的添加對卵泡生長的影響，這些添加物昂貴， 保存期有限，不適合廣大普通實驗室的條件要求 ( C e c c o n i ，等 2 0 0 4 ；K s i a z k i e w i c z ，等2 0 0 6 )。因此，沒有取得實質性的進步和 推廣。 小尾寒羊是我 國獨特的優秀遺傳資源 ，具 有 四季發情 ，全 年可配種產羔，繁殖力極高等特點 ( 何遠清 ，等2 0 0 6)；并且 體格高大，難產率低，并且相對較容易飼養管理 ( F r e e t l y ，等 2 0 0 4)，逐漸成為我國廣大養羊戶首先 的綿羊品種。為了快速擴 繁小尾寒羊這一優良品種，充分挖掘和利用屠宰后的小尾寒羊卵 巢 ，我們實驗室研究 了一套適合小尾寒羊卵巢腔前卵泡體外培養 體系 ，該培養體系高效 、經濟 ，完全適合一般普通實驗室的條件 要求。通過對早期卵泡的體外培養可以為胚胎工程等技術的研究 和應用提供大量的卵母細胞。 1 材料與方法 1 ． 1 培養液的成分 ( 1 )腔前 卵泡生長培養液 ( T C M一 1 9 9 生長液 )：T C M一 1 9 9 ( G i b c o 公司) + 5 ％發情羊血清或1 0 ％卵泡液+ l ％胰島素 ( S i g m a l 公司 ) + I T S( S i g m a l 公 司 )+ 2 0 m m ／ L H E P E S( S i g m a l 公司 ) + 青霉 素8 0 m s ／ L( S i g ma l 公司 ) + 鏈霉素6 0 m g ／ L( S i g m a ] 公司 ) ( 2)卵母 細胞成熟培養液 ( T C M一 1 9 9 成熟液 )：T C M 一 1 9 9 ( Gi b c o 公 司 )+ 2 mM谷 氨酰 胺+ 5 ％發情羊 血清 + 1 0 ％卵 泡液 + 2 0 m m ／ L H E P E S( S i g m a l 公司 ) + 青霉素8 0 m g ／ L( S i g m a l 公司 )+ 鏈霉素6 0 mg ／ L( S i g m a l 公 司 ) ( 3) 受精液 ( S O F 液 )：S O F( J i a n g ，等2 0 0 3)+ 2 0 m mo l ／ L HE P E S( G i b c 0 公 司 )+5 mmo l ／ L Na HC O ( S i g ma l 公 司 ) + 0 ． 3 ％B S A( S i g m a l 公司 )+ 青霉素8 0 m g ／ L( S i g m a l 公司 ) + 鏈霉素 6 0 m g ／ L( S i g m a l 公司 ) ( 4 )胚胎培養液 ：S O F( J i a n g ，等2 0 0 3 )- 4 - 2 n mo l ／ m l 谷氨酰 胺 ( S i g m a l 公 司 )+ 5 ％發情羊血清+ 1 ％ N E A A ( G i b e o 公司 ) + 3 ％ E A A ( G i b c o 公司 )+ 青霉素8 0 m g ／ L( S i g m a l 公司 )+ 鏈霉素6 0 m g ／ L ( S i g m a l 公司 ) + O ． 1 n mo l ／ m l E D T A( S i g ma 公司 ) 1 ． 2 腔前 日 泡的分離培養 從 當地定點屠宰場 收集小尾寒羊卵巢 ，置于含C a “、M g 的 磷酸鹽緩沖液 ( P B S)中，同時添加、青霉素8 0 ms ／ L 和鏈霉素 6 0 m g ／ L 。在2 h 內運回實驗室。隨后用等溫生理鹽水沖洗3 次。剪 去卵巢上附帶的輸卵管和系膜。在T C M一 1 9 9 生長液中將卵巢皮質 切割成0 ． 5 ×0 ． 5 ×0 ． 5 c m 大小的組織塊，參考C e c c o n i 等 ( 1 9 9 9 ) 手工分離腔前卵泡及少量粘連的間質 ，并根據腔前卵泡直徑 的大 小將腔前卵泡分成三類 ：小型 ( 平均直徑 ：1 3 0 ±1 0 m)，中 型 ( 1 8 5-4- 1 4 m)和大型 ( 2 5 0 ±1 0 m)卵泡 ，具體 的測量采 用倒置相差顯微鏡上的目鏡測微尺進行。將單個卵泡移入9 6 孔板 中，并添加2 5 l T C M一 1 9 9 生長培養液 ，覆蓋一層礦物油 ，置于 含有5 ％C O ： 的空氣，3 8 ．5 ℃ 飽和濕度培養箱培養6 d ，隔天半量換 液 。培養始末記 錄每個 卵泡的直徑 ，在 光鏡 下顆粒細胞中