小徑納米纖維素管的生物制備及其表征

第 2 2卷第 3期 2 0 1 4年 9月 纖 維 素 科 學 與 技 術 J o u r n a l of Ce l l u l os e S c i e nc e a n d Te c h no l o g y Vb l _ 2 2 NO ． 3 S e p t ． 2 0 1 4 文章 編號：1 0 0 4 — 8 4 0 5 ( 2 0 1 4 ) 0 3 - 0 0 0 1 — 0 7 小徑納米纖維素管的生物制備及其表征 洪楓 ， 蔣燕光， 陳琳木 ， 魏斌 ( 東華大學 化學化工與生物工程學院 微生物工程與工業生物技術研究組，上海 2 0 1 6 2 0 ) 摘要：以透氧硅膠雙套管為模具，設計組裝了一套新型生物反應裝置，利用紅茶菌和套管法生產細 菌纖維素 ( B C)小徑人工血管材料。研究發現，細菌纖維素可以分別在內外兩根硅膠管的外表面和內 表面 同時生成 ，并最終長 到一起形成整體 B C 管 。獲得的 B C 管不僅 具有較 好的強度 和光滑平 整的內 外表面，而且納米纖維交織緊密，無纖維分層現象，具有突出優點和應用潛力。該制備方法簡便易行， 成本低廉，生產效率高，可工業化生產。 關鍵詞 ：細菌纖 維素 ；人工血管；納米纖維 ；生物反 應器 中圖分類號 ：R 3 1 8 ；T B3 9 ；Q8 1 5 文獻標識碼 ：A 長期 以來 ，全世界科學家都在尋找小徑血管替代材料，這種材料必須滿足以下要求 ：良好 的生物和血 液相容性，抗血壓的機械強度和 良好順應性，血液組分的不可透過性 以及可消毒。目前 己商品化的血管替 代材料有膨體聚四氟乙烯 ( e P T F E) 、聚對苯二 甲酸 乙二醇酯 ( P E T) 、聚氨基 甲酸酯或者聚硅酮等 。通過 采用涂覆肝素、固定化尿激酶，或者等離子體處理材料的內壁，以及在材料內壁移植內皮細胞等方法后， 這些血管替代物均能很好地滿足大徑 ( 管徑大于 6 mm)外科血管手術要求。但是當這些材料用于替代 占 人體血管大多數的微血管和小血管 ( 管徑為 1 ～6 mm)時，往往在血管結合區域 出現 內膜細胞增生現象、 大規模血管周纖維化或者管 內形成大量血栓等問題。因此在顯微外科手術中，這些材料的臨床應用并不成 功， 目前仍采用 自體血管移植為主L 1 J 。 細菌纖維素 ( b a c t e r i a l c e l l u l o s e ，簡稱 B C)又稱微生物纖維素 ( mi c r o b i a l c e l l u l o s e ) ，是一種 由細菌分 泌產生的純天然納米結構的高純度纖維素。該纖維素 由于具有獨特的三維納米纖維網狀結構，極強的持水 性、高聚合度、結晶度和濕強度 ，以及 良好的生物相容性和無過敏反應 ，因此在人工血管、傷科敷料 、組 織工程支架等生物醫學領域具有廣闊應用前景【 3 ‘ 。 目前 國內外細菌纖維素人工血管材料的制備方法主要有 以下幾種 ：玻璃套管法 ¨ 、滲氧單管法[ 8 , 1 2 - 1 5 】 、后期加工法[ ， 】 、動態纏繞法[ “ 等。這些方法制備的管狀 細菌纖維素材料具有一定的局限性 ，如生長周期長、效率低 、長度受限、厚度不可控 、材料易分層、表面 不平整、強度不夠好等 。基于 以上現狀 ，本文 旨在開發出一種制備 BC管的新裝置及技術方法，并對獲得 的 BC管進行初步評價，擬克服傳統技術方法制備的 B C管所具有的以上缺陷，為今后的進一步研究奠定 基 礎 。 收稿 日期：2 0 1 4 ． 0 2 ． 1 8 基金項 目：國家 自然科學基金 ( 5 1 3 7 3 0 3 1 ) ；教育部新世紀優秀人才支持計劃項 目 ( NC E T - 1 2 ． 0 8 2 8 ) ；上海市科委項 目 ( 1 2 n m0 5 0 0 6 0 0 ) ；中央高校基本科研業務費專項資金資助項 目。 作者簡介：洪 楓 ( 1 9 7 0 ～ ) ，男，福建閩侯人，教授，博士生導師；主要從事細菌纖維素的低成本高效制備及其應用的研究。 f h o n g @d h u ． e d u ． c a 通訊作者：陳 琳 ( 1 9 7 3 ～) ，女，博士，副教授；主要從事細菌纖維素的高效制備及其應用的研究。l c h e n @d h u ． e d u ． c n 2 纖 維 素 科 學 與 技 術 第2 2 卷 1 實驗 1 ． 1 菌種 、試劑及培養基 實驗所用試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。實驗所用菌株：紅茶菌 ( K o m b u c h a )由 本實驗室保藏。紅茶菌液體培養基： 將水煮沸，加入 0 ．5 ％ ( w ／ V )的綠茶，浸泡 2 0 rain后濾去茶葉渣獲得 綠茶汁，然后加入蔗糖 1 0 0 g ／ L ，蛋 白胨 3 g ／ L ，酵母浸膏 5 g ／ L，p H 自然 ，6 5 “ C下巴氏滅菌 3 0 r a i n 。 1 ． 2 生物反應器的設計組裝【 l 馴 B C管 的發酵制備與 B C膜 的制備方法類似，培養基、菌種及其它培養條件大體相同，最重要 的是模 具的開發。只要開發出的模具能滿足微生物對氧和營養物質的需求，讓微生物產生纖維素并按照模具的形 狀生長，即可制備 出管狀的 B C材料 ，經過洗滌純化等處理即可 。 反應器由兩根外徑、厚度和長度均不同，但具有滲氧性能的市售薄壁硅膠管，軸對稱的固定在一起所 組成的雙套管 ( 如圖 1 所示) 。其 中一根外徑為 9 mi l l 、厚度為 0 ． 5 mm、長度為 6 c m，另一根外徑為 3 mi l l 、 厚度為 O ． 5 m m、長度為 8 c m，管狀材料間隙 ( 2 ． 5 m m)中裝液量約為 1 ．5 mL ，內管中通入氧氣，并將整 個反應裝置放入充滿氧氣的密閉環境 中，進行靜態培養，纖維素生產菌便會分別在外管的內表面和 內管的 外表面同時合成細菌纖維素 ，并最終生長到一起成為一根整體 B C 管 ( B C 管 內徑是模具 內管的外徑，即 3 r n l T 1 ) 。 1 ．充滿氧氣或者空氣的密閉容器：2 ．外硅膠管；3 ．已接種的發酵培養基；4 ．內硅膠管；5 ．固定硅膠管4的圓柱空心塞： 6 ．向內硅膠管模具內腔中充氧氣或空氣；7 ． 外硅膠管的內表面形成的B C層；8 ．內硅膠管的外表面形成的 B C層 圖 1 生物反應器示意 圖 1 - 3 菌種培養及 B C管的發酵制備 紅茶菌按 2片直徑 0 ． 5 c m 圓片菌膜的接種量接入 5 0 mL液體種子培養基 ，于 3 0 ℃、1 6 0 r ／ rai n條件 下 搖床培養 1 2 h后備用。在圖 1中管狀材料 間隙 ( 3 )中注入 1 ． 5 mL培養后的菌懸液，并確保不漏液 ，然后 向內管 ( 4 )中通入氧氣，然后將整個生物反應裝置放入充滿氧氣的密閉環境 ( 1 )中，于 3 O ℃恒溫靜態培 養 3 ～7天。 1 ． 4 B C管的處理 將制備的 BC管浸泡于 1 ％ ( 叭 )的 Na O H溶液中，8 0 ℃水浴處理 1 2 0 mi n ，除去